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培養基的滅菌

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● 知識要點和教學要求

1)、了解滅菌的原理和方法

2)、了解培養基的滅菌

3)、掌握濕熱滅菌原理和影響滅菌的因素

4)、掌握間歇滅菌

5)、掌握連續滅菌

● 能力培養要求

通過本章節的學習,學生能掌握培養基滅菌的原理和方法及其影響滅菌的因素。

● 教案內容

由于雜菌的污染,使生物反應中的基質或產物因雜菌的消耗而損失,造成生產能力的下降;

由于雜菌所產生的一些代謝產物,或在染菌后改變了培養液的某些理化性質,使產物 的提取和分離變得困難,造成收率降低或使產品的質量下降;

雜菌會大量繁殖,會改變反應介質的PH值,從而使生物反應發生異常變化;

雜菌可能會分解產物,從而使生產過程失敗;

發生噬菌體污染,微生物細胞被裂解,而使生產失敗,等等。

5.1 滅菌的原理和方法

滅菌是指利用物理或化學法殺或除去物料及設備中一切有生命物質的過程。常用的滅菌方法大致有以下幾種:

1. 化學試劑滅菌法

常用的化學試劑有甲醛、氯氣(或次氯酸鈉)、高錳酸鉀、環氧乙烷等。

2. 電磁波、射線滅菌法

電磁波、紫外線或放射性物質

3. 干熱滅菌法

干熱滅菌條件為在160℃下保溫1h。

4. 濕熱滅菌法

利用飽和蒸汽進行滅菌的方法稱為濕熱滅菌法。由于蒸汽具有很強的穿透能力,而且在冷凝時會放出大量的冷凝熱,很容易使蛋白質凝固而殺死各種微生物。從滅菌的效果來看,干熱滅菌不如濕熱滅菌有效,溫度升高10℃時,滅菌速度常數僅增加2-3倍,而濕熱滅菌對耐熱芽孢的滅菌速度常數增加的倍數可達到8-10倍,對營養細胞則更高。同時,蒸汽的來源方便,價格低廉,滅菌效果可靠,是目前最為基本的滅菌方法。一般的濕熱滅菌條件為:121℃,30min。

5. 過濾除菌法

利用過濾方法制備無菌空氣。

6. 火焰滅菌法

僅適用于接種針、玻璃棒、三角瓶口等的滅菌。

5. 2培養基的滅菌

但高溫雖然能殺死培養基中的雜菌,同時也會破壞培養基中的營養成分,甚至會產生不利于菌體生長的物質。因此,在工業培養過程中,除了盡可能殺死培養基中的雜菌外,還要盡可能減少培養基中營養成分的損失,最常用的滅菌條件是120℃,20-30min。

衡量熱滅菌的指標很多,最常用的是“熱死時間”,即在規定溫度下殺死一定比例的微生物所需要的時間。殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度,在此溫度下,殺死全部微生物所需要的時間稱為致死時間。在致死溫度以下,溫度越高,致死時間就越短。一些細菌芽孢菌等微生物細胞和孢子,對熱的抵抗力不同,因此它們的致死溫度和時間也有差別,見表5-3和表5-4。微生物對熱的抵抗力常用“熱阻”表示。熱阻是指微生物在某一特定條件(主要是溫度和加熱方式)下的致死時間。相對熱阻是指微生物在某一特定條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間的比值。表5-5列出了某些微生物的相對熱阻。

表5-5某些微生物的相對熱阻及其對一些滅菌劑的相對抵抗力(大腸桿菌相比較)

滅菌方式大腸桿菌霉菌孢子細菌芽孢嗜菌體或病毒

干熱滅菌1 2-10 1000 1

濕熱滅菌1 2-10 3×1051-5

苯酚1 1-2 1×10930

甲醛1 2-10 250 2

紫外線1 5-100 2-5 5-10

由表5-5可知,芽孢或孢子的熱阻要比生長期營養細胞的熱阻大得多,這是由于芽孢或孢子內吡啶二羧酸含量對熱阻的增加有關。另外,芽孢子中蛋白質含水量較營養細胞低(特別是游離水分少),也是芽孢耐熱強的一個原因。圖5-2和圖5-3分別為大腸桿菌營養細胞和FS7954芽孢桿菌的芽孢在不同溫度下的死亡情況。

5.3濕熱滅菌原理和影響滅菌的因素

在發酵工業中,對培養基和發酵設備的滅菌,廣泛使用濕熱滅菌法。工廠里,蒸汽比較容易獲得,控制操作條件方便,是一種簡單而又價廉、有效的滅菌方法。用濕熱滅菌的方法處理培養基,其加熱溫度和受熱時間與來菌程度和營養成分的破壞都有關系。營養成分的養活將影響菌種的培養和產物的生成,所以滅菌程度和營養成分的破壞成為滅菌工作中的主要矛盾,恰當掌握加熱溫度和受熱時間是滅菌工作的關鍵。

5.3.1滅菌動力學

1. 微生物的死亡速率

1)對數殘留定律

微生物受熱死亡的原因,主要是因高溫使微生物體內的一些重要蛋白質,如酶等,發生凝固、變性,從而導致微生物無法生存而死亡。微生物受熱而喪失活力,但其物理性質不變。在一定溫度下,微生物的受熱死亡遵照分子反應速度理論。在滅菌過程中,活菌數逐漸減少,其減少量隨殘留活菌數的減少而遞減,即微生物的死亡速率與任一瞬時殘存的活菌數成正比,如圖5-2所示,大腸桿菌的死亡曲線為線性關系,稱之為對數殘留定律,也即反映為一級化學反應動力學為:

-dN/dt=KN

式中,N—殘存的活菌數;t—滅菌時間(s);K—滅菌速度常數(s-1),與稱反應速度常數或比死亡速度常數,此常數的大小與微生物的種類與加熱溫度有關;dN/dt—活菌數瞬時變化速率,即死亡速率。

上式通過積分可得:Nt/N0=e-kt

t=1/KlnN0/Nt=2.303/KlgN0/Nt

式中:N0—開始滅菌(t=0)時原有活菌數;Nt=經時間t后殘存活菌數。

上式是計算滅菌的基本公式,滅菌速度常數K是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據。各種微生物在同樣的溫度下K值是不同的,K值愈小,則此微生物愈耐熱。

即使對于同一微生物,也受微生物的生理狀態、生長條件及滅菌方法等多種因素的影響,其營養細胞和芽孢的比死亡速率也有極大的差異,就微生物的熱阻來說,細菌芽孢是比較耐熱的,孢子的熱阻要比生長期細胞大得多。例如,在121℃時,枯草桿菌FS5230的K為0.47-0.063s-1,梭狀芽孢桿菌PA3679的K為0.03s-1,嗜熱芽孢桿菌FS1518的K為0.013s-1,熱芽孢桿菌FS617的K為0.048s-1。

從上述的微生物對數死亡規律和非對數死亡動力學模型方程式可知,如果要達到徹底滅菌,即滅菌結束時殘留的活微生物數等于0,則滅菌所需的時間應為無限長,這在實際中是不可能的。因此,工程上,在進行滅菌的設計時,常認為N/N0=0.001,即在1000次滅菌中,允許有一次失敗。

5.3.2滅菌的溫度和時間

微生物的受熱死亡屬于單分子反應,其滅菌速率常數K與溫度之間的關系可用阿累尼烏斯公式表示:

K=Aexp(-ΔE/RT) (5.8)

或 lnK=lnA--ΔE/RT (5.9)

式中:A---頻率常數,也稱阿累尼烏斯常數,s-1;R---氣體常數,8.314J/mol·K;T---絕對溫度,K;ΔE---微生物死亡活化能,J/mol。

由此可見,ΔE/R是微生物受熱死亡時對溫度敏感性的度量,此值越大,表明微生物死亡速率隨溫度的變化越敏感;反之,就越不敏感,因此,在滅菌操作中,ΔE/R是一個十分重要的參數。

當培養基被加熱滅菌時,?;岢魷終庋拿?,這就是,加熱時,微生物固然會被殺死,但培養基中的有用成分也會隨之遭到破壞,那么有何良策可以既達到滅菌要求,同時又不破壞或盡可能少破壞培養基中的有用成分呢?

實踐證明,在高壓加熱的情況下,培養基中的氨基酸和維生素極易被破壞,如在121℃,僅20min,就有59%的賴氨酸和精氨酸及其他堿性氨基酸被破壞,蛋氨酸和色氨酸也有相當數量被破壞。因此,必須選擇一個既能滿足滅菌需要,又可使培養基的破壞盡可能養活的滅菌工藝條件。

由于滅菌時殺死微生物的活化能大于培養基成分的破壞活化能值,因此:

即隨著溫度的上升,微生物的死亡速率常數增加倍數要大于培養基成分的破壞速率的增加倍數。也就是說,當滅菌溫度上升時,微生物殺死速率的提高要超過培養基成分的破壞速率的增加。

從上述的分析可知,在熱滅菌過程中,同時會發生微生物死亡和培養基破壞這兩種過程,且這兩種過程的進行速度都隨溫度的升高而加速,但微生物的死亡速率隨溫度的升高更為顯著。因此,可選擇合適的滅菌溫度和時間來調和二者之間的矛盾。

一個事例為,滅菌要達到殺死99.99%的細菌芽孢,有兩種方法可以采用,一種是118滅菌15min,另一種是128滅菌5min。而培養基中B族維生素的保留值在前一種方式為90%,后一種方式為95%。由此可見,在高溫下滅菌,時間是一個非常重要的因素,圖5-6和表5-8分別表示殺死細菌芽孢與保留B族維生素的時間與溫度關系以及在不降低規定的滅菌前提下(),滅菌溫度、時間和營養成分破壞量的關系。

表5-8滅菌溫度、時間與營養成分破壞量的關系()

滅菌溫度滅菌時間(分)營養成分破壞量%

100 400 99.3

110 36 67.0

115 15 50.0

120 4 27.0

130 0.5 8.0

145 0.08 2.0

150 0.01 1.0

由此可見,若要減少營養成分的破壞,可升高溫度滅菌。

據此,可以在滅菌時選擇較高的溫度、較短的時間,這樣便既可達到需要的滅菌程度,同時又可減少營養物質的損失。

5.3.3影響滅菌的因素

1) 培養基成分

固體培養基的滅菌時間要比液體培養基的滅菌時間長。

2) 培養基的物理狀態

培養基的PH值愈低,滅菌所需的時間就愈短。

3) 培養基的PH值

4) 培養基中的微生物數量

因此,在實際生產中,不宜采用嚴重霉腐的原料和腐敗的水質,因為這類原料中不但有效成分少,而且微生物數量中,徹底滅菌比較困難。

5) 微生物細胞中水含量

6) 微生物細胞菌齡

年輕細胞容易被殺死。

7) 微生物的耐熱性

各種微生物對熱的抵抗力是不同的,細菌的營養體、酵母、霉菌的菌絲體對熱較為敏感,而放線菌、酵母、霉菌孢子比營養細胞的抗熱性要強,細菌芽孢的抗熱性就更強。一般講,無芽孢的細菌或霉菌孢子在100以下加熱3-5min都可被殺死,但是有些細菌芽孢的熱阻較大,100、30min仍未被殺死,所以滅菌的徹底與否應以殺死細菌孢為標準。

8) 空氣排除情況

蒸汽滅菌過程中,溫度的控制是通過控制罐內的蒸汽壓力來實現。壓力表顯示的壓力應與罐內蒸汽壓力相對應,即壓力表的壓力所對應的溫度應是罐內的實際溫度。但是如果罐內空氣排除不完全,壓力表所顯示的壓力就不單是罐內蒸汽壓力,還包括了空氣分壓,因此,此時罐內的實際溫度就低于壓力表顯示壓力所對應的溫度,鳳致造成滅菌溫度不夠而滅菌不徹底,如表5-12所示。

表5-12蒸汽壓力與溫度的關系

蒸汽壓力(atm) 相應的溫度(℃)空氣完全驅除程度罐內實際溫度(℃)

0.3 107.7 完全驅除121.6

0.7 115.5 驅除非/3 115.0

1.0 121.6 驅除此之外/2 112.0

1.3 126.6 驅除此之外/3 109.0

1.5 130.5 全未驅除100.0

9) 攪拌

10) 泡沫

5.4間歇滅菌

5.4. 1間歇滅菌

培養基的間歇滅菌就是將配制好的培養基放在發酵罐或其他裝置中,通入蒸汽將培養基和所用設備一起進行加熱滅菌的過程,通常也稱為實罐滅菌。

間歇滅菌過程包括升溫、保溫和冷卻等三個階段,圖5-7為培養基間歇滅菌過程中的溫度變化情況。

5.4.2間歇滅菌的計算

嚴格地講在升溫階段的后期和冷卻階段的前期,培養基的溫度很高,因而具有一定的滅菌作用。

由此可見,滅菌過程中加熱和保溫階段的滅菌作用是主要的,而冷卻階段的滅菌作用是次要的,一般很小,可以忽略不計。此外,還應指出的是,應當避免過長時間的加熱階段,因為加熱時間過長,不僅會破壞營養物質,而且也有可能引起培養液中某些有害物質的生成,從而影響培養過程的順利進行。

在實際生產中,也可能遇到所供蒸汽不足、溫度不夠高的情況,這時可以適當延長滅菌

時間。生產上甚至有用100蒸煮而達到徹底滅菌的實例。如要做固體曲而沒有高溫蒸汽

時,可將原料用100蒸汽蒸30min,殺死其中的營養細胞,但孢子與細菌的芽孢沒有被

殺死。將蒸過的原料置于室溫下過夜,未被殺死的孢子便發芽生長,芽孢發育成營養細

胞,再蒸30min便可殺死。如此連續反復進行2-3次,亦可達到徹底滅菌的目的。

5.4.3間歇滅菌的操作

間歇滅歇是在所用的發酵罐或其他培養裝置中進行的,它是在配制罐中配好培養基后,通過專用管道輸入發酵罐等培養設備中,然后開始滅菌。在進行培養基的間歇滅菌之前,通常先將發酵罐等培養裝置的分空氣過濾器進行滅菌,并且用空氣將分過濾器吹干??濟鵓?,應先放去夾套或蛇管中的冷水,開啟排氣管閥,通過空氣管向發酵罐內的培養基通入蒸汽進行加熱,同時,也可在夾套內通蒸汽進行間接加熱。當培養基溫度升到

70左右時,從取樣管和放料管向罐內通入蒸汽進一步加熱,當溫度升至120,罐壓為1*105Pa(表壓)時,打開接種、補料、消泡劑、酸、堿等管道閥門進行排汽,當然在保溫過程中,應注意凡在培養基液面下的各種進口管道都應通入蒸汽,而在液面以上的其余各管道則應排放蒸汽,這樣才能不留死角,從而保證滅菌徹底。保溫結束后,依次關閉各排汽、進汽閥門,待罐內壓力低于空氣壓力后,向罐內通入無菌空氣,在夾套或蛇管中通冷水降溫,使培養基的溫度降到所需的溫度,進行下一步的發酵和培養。

由于培養基的間歇滅菌不需要專門的滅菌設備,投資少,對設備要求簡單,對蒸汽的要求也比較低,且滅菌效果可靠,因此,間歇滅菌是中小型生產工廠經常采用的一種培養基滅菌方法。

5.5連續滅菌

5.5. 1培養基的連續滅菌

培養基的連續滅菌,就是將配制好的培養基在向發酵罐等培養裝置輸送的同時進行加熱、保溫和冷卻而進行滅菌。圖5-9為連續滅菌過程中溫度的變化情況。由圖可以看出,連續滅菌時,培養基可在短時間內加熱到保溫溫度,并且能很快地被冷卻,因此可在比間歇滅菌更高的溫度下進行滅菌,而由于滅菌溫度很高,保溫時間就相應地可以很短,極有利于減少培養基中的營養物質的破壞。

5.5. 2連續滅菌的基本流程

培養基連續滅菌的基本流程如圖5-10所示。連續滅菌的基本設備一般包括(1)配料預熱罐,將配制好的料液預熱到60-70,以避免連續滅菌時由于料液與蒸汽溫度相差過大而產生水汽撞擊聲;(2)連消塔,連消塔的作用主要是使高溫蒸汽與料液迅速接觸混和,并使料液的溫度很快升高到滅菌溫度(126-132);(3)維持罐,連消塔加熱的時間很短,光靠這段時間的滅菌是不夠的,維持罐的作用是使料液在滅菌溫度下保持5-7min,以達到滅菌的目的;(4)冷卻管,從維持罐出來的料液要經過冷卻排管進行冷卻,生產上一般采用冷水噴淋冷卻,冷卻到40-50后,輸送到預先已經滅菌過的罐內。

圖5-11為噴射加熱連續滅菌流程,流程中采用了蒸汽噴射器,它使培養液與高溫蒸汽直接接觸,從而在短時間內可將培養液急速升溫至預定的滅菌溫度然后在該溫度下維持一段時間滅菌,滅菌后的培養基通過一膨脹閥進入真空冷卻器急速冷卻,從圖中可以看出,由于該流程中培養基受熱時間短,營養物質的損失也就不很嚴重,同時該流程保證了培養基物料先進先出,避免了過熱或滅菌不徹底等現象。

圖5-12為薄板換熱器連續滅菌流程,流程中采用了薄板換熱器作為培養液的加熱和冷卻器,蒸汽在薄板換熱器的加熱段使培養液的溫度升高,經維持段保溫一定時間后,培養基在薄板換熱器的冷卻段進行冷卻,從而使培養基的預熱、加熱滅菌及冷卻過程可在同一設備內完成。該流程的加熱和冷卻時間比噴射加熱連續滅菌流程要長些,但由于在培養基的預熱過程同時也起到了滅菌后培養基的冷卻,因而節約了蒸汽和冷卻水的用量。

培養基的連續滅菌的優點是滅菌的溫度較高,滅菌時間較短,培養基的營養成分受砉珠程度較低,從而保證了培養基的質量,同時由于連續滅菌過程不在發酵罐等設備中進行,提高了發酵罐等設備的利用率。當然與間歇滅菌過程相比,連續滅菌過程的不足之處是過程所需的設備較多,操作較為麻煩,染菌機會也相應較多。

培養基采用連續滅菌時,加熱器、維持罐(管)和冷卻器以及發酵罐等都應先進滅菌,然后才能進行培養基的連續滅菌。同時組成培養基的耐熱性物質和不耐熱性物質可在不同溫度下分開滅菌,以減少物質的受熱破壞程度,也可將碳源與氮源分開滅菌,以免醛基與氨基發生反應,防止有害物質的生成。

5.6間歇滅菌與連續滅菌的比較

間歇滅菌或連續滅菌都有各自的優點和缺點,現比較如下。

表5-14間歇滅菌與連續滅菌的比較

 

滅菌方式

優點

缺點

連續滅菌

1.        滅菌溫度高,可減少培養基中營養物質的損失

2.        操作條件恒定,滅菌質量穩定

3.        易于實現管道化和自控操作

4.        避免了反復的加熱和冷卻,提高了熱的利用率

5.        發酵設備利用率高

1.        對設備的要求高,需另外設置加熱、冷卻裝置

2.        操作較麻煩

3.        染菌的機會較多

4.        不適合于含大量固體物料的滅菌

5.        對蒸汽的要求高

間歇滅菌

1.        設備要求低,不需另外設置加熱、冷卻裝置

2.        操作要求低,適于手動操作

3.        適合于小批量生產規模

4.        適合于含有大量固體物質的培養基的滅菌

1.        培養基的營養物質損失較多,滅菌后培養基的質量下降

2.        需進行反復的加熱和冷卻,能耗較高

3.        不適合于大規模生產過程的滅菌

4.        發酵罐的利用率較低

 

由表可見,無論在理論上或者在實踐上,與間歇滅菌過程相比,連續滅菌的優點十分明顯。因此,連續滅菌越來越多地被用培養基的滅菌。